Вхід на сайт

Реєстрація  |   Я забув пароль

Вимоги до методів аналізу молока за показниками безпеки при експорті його до країн ЄС

28 серпня 2013

Вимоги до методів аналізу молока за показниками безпеки при експорті його до країн ЄС

Д. Янович

Завідувач лабораторії інструментальних методів контролю ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, к.с-г.н.


Тема контролю за показниками безпеки продукції тваринного походження, вимагає окремого розгляду питань пов'язаних із контролем молока, та молокопродуктів, які виробляються на Україні. Аналіз результатів контролю експортних партій сухого молока виробленого в Україні, одержаних протягом періоду 2003-2006 років, якій показує наявність в молоці українського виробництва залишків заборонених антибіотиків, вимагає уважніше подивитись на цю проблему.

Оцінка потенціалу України в аграрній сфері, дозволяє прогнозувати в майбутньому значне збільшення об'єму експорту тваринницької продукції, але лише за умов приведення українського законодавства до світових вимог. Зменшення в Україні кількості великих спеціалізованих молочних господарств при одночасному збільшенні кількості молочного поголів'я в дрібних приватних господарствах, створює додаткові проблеми для молокопереробних підприємств в галузі контролю сировини. Більшість молокопереробних підприємств використовують збірну сировину одержану в малих преватних господарствах. В Україні, на відміну від більшості країн Європи, ще не існує процедури ліцензування господарств-виробників молока, якою передбачається періодичний контроль за його якістю та безпекою та позбавлення ліцензії у разі виявлення порушень. Відсутність таких законодавчих норм перекладає усю відповідальність за показники безпеки на молокопереробні підприємства.

Окрім контролю санітарного стану технологічного обладнання та мікробіологічних показників молока, на контрольні лабораторії молокопереробних підприємств лягає обов'язок контролювати вміст в молоці небажаних речовин, які погіршують його технологічну якість та загрожують здоров'ю споживачів. В даному аспекті найбільшої уваги вимагає контроль за вмістом залишкових кількостей антимікробних препаратів, що застосовуються для лікування молочних тварин.   В першу чергу це стосується контролю за вмістом заборонених до використання антибіотиків таких як хлорамфенікол (левоміцетин), який не має встановлених МДР, тобто виявлення його, навіть найменшої  кількості в молоці, передбачає вилучення та знищення продукції.

Хлорамфенікол, більш відомий в Україні під назвою левоміцетин –антибіотикширокого спектру дії, який не зважаючи на його високу ефективність проти збудників багатьох інфекційних захворювань, заборонений для застосування у ветеринарії рішенням WHО (Всесвітня організація охорони здоров'я) через побічні ефекти, виявлені при поглибленому вивченні впливу цього препарату на людей. Зокрема, встановлена його здатність викликати в окремих випадках фатальне захворювання кровотворної системи – апластичну анемію. Оскільки вивчення не встановило дозо-залежної границі між найменшою безпечною концентрацією та концентрацією, яка викликає захворювання, існує ймовірність того, що найменша концентрація хлорамфеніколу здатна спричинити захворювання людей у генотипі яких закладена підвищена чутливість до цього препарату. Генетично обумовлена підвищена чутливість до хлорамфеніколу трапляється серед людей  в одному випадку з 40 тис. Особливо чутливі до його впливу діти віком до 1 року. Небезпечна концентрація хлорамфеніколу може потрапити в організм людини не тільки при лікуванні, але й при споживанні продуктів, одержаних від тварин, яких лікували хлорамфеніколом. Зважаючи на це США, ЄС та більшості країн світу заборонили застосування хлорамфеніколу у ветеринарії для продуктивних тварин, а в медичній практиці призначають його, як препарат групи вибору. З 01.10.02 року хлорамфенікол у числі інших препаратів, визнаних WHO небезпечними, заборонений в Україні для застосування продуктивним тваринам (наказ ДДВМ №23 від 04.04.02 року). Нажаль лікування тварин не єдиний шлях потрапляння хлорамфеніколу в молоко. Відомі випадки коли власники молочних тварин, не зважаючи на заборону, застосовують цей препарат для  продовження терміну придатності молока, передбаченого для продажу на молочні підприємства. Навіть незначна кількість цього антибіотика здатна тимчасово зупинити ріст мікрофлори в молоці і призупинити його скисання. В той же час навіть четверта частина таблетки хлорамфеніколу розчиненої недбалим власником у бідоні молока, здатна зробити непридатним об'єм десяти тонної ємності, в яку вона попаде разом із збірним молоком. Тому заборона препарату передбачає створення системи контролю за його вмістом в продукції, що забезпечує виконання наказу.

Вимоги до методів контролю за вмістом хлорамфеніколу в продуктах тваринного походження регламентуються встановленням мінімальної необхідної межі визначення (МНМВ). На час уведення заборони на застосування хлорамфеніколу в Україні, значення МНМВ для хлорамфеніколу встановлено згідно рішення 2003/181/EC на рівні 0,3 мкг/кг. Досягнути такого рівня чутливості неможливо за застосування традиційних методів контролю.

У Державному науково-дослідному контрольному інституті ветеринарних препаратів та кормових добавок (ДНДКІ) протягом 2000-2006 років проводилось випробування різних аналітичних методів для контролю за вмістом залишкових кількостей хлорамфеніколу у продуктах тваринного походження ( молоко, сухі молочні продукти, мед, м'ясо, яйця). Протягом зазначеного періоду проведено порівняльну оцінку різних методів контролю хлорамфеніколу (мікробіологічні, ТШХ, ВЕРХ, CHARMII, ІФА/ELISA, РХ/МС/МС) у продуктах тваринного походження.

Мікробіологічні методи, які є високочутливими для контролю за вмістом антибіотиків групи бета-лактамів, виявились непридатними для контролю хлорамфеніколу. Встановлено що, як класичний чотирьох лунковий мікробіологічний метод із застосуванням тест-культури B. subtilis, так і швидкі мікробіологічні методи можуть виявити залишки хлорамфеніколу на рівні всього 300 - 500 мкг/л.

Хроматографічними методами ТШХ та ВЕРХ/УФ вдалось досягнути, за умов концентрування зразків, відповідно рівнів 10 мкг/мл та 2 мкг/мл.

Аналіз даних, одержаних за застосування вибраних методів показав непридатність, як мікробіологічних, так і хроматографічних методів із фотометричним детектуванням для контролю за вмістом залишків хлорамфеніколу в продуктах тваринного походження на рівні МНМВ.
ІФА/ELISA серед обраних скринінгових методів аналізу є найбільш чутливими і забезпечує нижню межу визначення хлорамфеніколу у зразках на рівні 0,05 мкг/кг, що відповідає рівню МНМВ і дорівнює  чутливості таких арбітражних методів, як РХ/МС/МС, при більшій продуктивності, простоті виконання та меншій собівартості. Ефективне застосування методу ELISA описано в ряді наукових джерел а також регламентовано для застосування у статусі офіційних скринінгових методів у країнах ЄС. З метою оцінки достовірності результатів одержаних методом ELISA, нами перевірено статистичні параметри даного методу за критеріями, викладеними у рішенні ЄС 2002/657 щодо методів контролю за залишками в продуктах тваринного походження. У таблиці 1 наведено дані щодо застосування методу ELISA для кількісного аналізу хлорамфеніколу у різних типах матриць (м'ясо, молоко, мед, яйця), яке проводилось на фортифікованих зразках виготовлених шляхом додавання різних концентрацій стандартних розчинів хлорамфеніколу до вищезгаданих матриць.

Таблиця 1. Визначення хлорамфеніколу у модельних зразках молока, меду, м'яса та яєць  методом ІФА/ELISA

№№ зразків

Змодельована концентрація хлорамфеніколу у матриці мкг/кг(л)

Одержані результати мкг/кг(ppb)

молоко

 

мед

м'ясо **

яйця

1

0*

0,12

0,064

0,14

0,22

2

0,20

0,27

0,19

0,32

0,17

3

0,50

0,42

0,67

0,49

0,59

4

1,00

-

1,20

1,12

-

5

4,00

-

5,20

3,25

-

*- контрольний негативний зразок; **- грудний м'яз курчат.

Випробування методом ІФА/ELISA зразків, які містили матриці різних продуктів тваринного походження, показало, що найвищі значення нульової проби спостерігаються при аналізі сухих молочних продуктів. Порівняльний аналіз зроблений у ДНДКІ та інших акредитованих лабораторіях із застосуванням методів підтвердження РХ/МС/МС показав високу достовірність результатів одержаних методом ІФА/ELISA. У таблиці 2 наведено данні про порівняння результатів аналізу одержаних для реальних зразках сухого молока.

Таблиця 2. Порівняльна оцінка результатів з визначення хлорамфеніколу у сухому молоці (мкг/кг), одержаних у різних лабораторіях методом ІФА/ELISA та підтверджена методом РХ/MС/MС

№№ зразків

ELISA

(ДНДКІ)1

ELISA

(ДНДКІ)1

ELISA

(R-biopharm)1

ELISA

(R-biopharm)2

CHARM

(PIWet)

**

РХ/MС/MС

(R-biopharm)

1035

3,05

3,2

2,84

2,54

-

5,9

1035A*

-

-

2,76

2,97

>0,3

5,5

1036

3,22

3,29

3,44

3,31

-

-

1036A*

-

-

3,06

3,32

>0,3

-

1037

0,62

0,73

0,63

0,65

-

0,7

1037A*

-

-

0,55

0,68

>0,3

-

*-проби відібрані повторно від арбітражних зразків;

**-Державний інститут ветеринарії, Польща, м. Пулави;

1- аналіз виконано тест-набором однієї серії 4333А;

2- аналіз виконано тест-набором іншої серії 04134; 

Як видно з результатів представлених у таблиці 2, значення одержані методом ELISA, для зразків 1035 і 1036 не відрізняються між собою більше ніж на 12 %, що менше за допустиму похибку для даного методу. Значення одержані для зразка 1035 методом  РХ/МС/МС перевищують значення одержані методом ELISA майже вдвічі. В той же час значення одержані методом ELISA для зразка 1037 не відрізняються між собою а також від значень одержаних методом  РХ/МС/МС  більше, ніж на 8%. Одержані дані свідчать про кращу збіжність результатів двох методів в середньому діапазоні калібрувальної кривої та здатність надійно виявляти зразки вміст хлорамфеніколу в яких перевищує МНМВ.

Методика контролю залишкових кількостей хлорамфеніколу, у молоці та сухих молочних продуктах, розроблена у ДНДКІ із застосуванням методу РХ/МС/МС, дає найбільш достовірні дані. Згідно вимог європейського законодавства даний метод є арбітражним при контролі препаратів заборонених до використання або незареєстрованих субстанцій. При перевірці арбітражним методом результатів одержаних скринінговим методом ІФА/ELISA нами встановлено, що різниці між результатами у відсотках, одержаними скринінговим методом та методом підтвердження, не перевищують 18%, що повністю відповідає встановленим вимогам щодо методів (2002/657). При відборі зразків для порівняльного аналізу ми ставили за мету перевірку достовірності результатів одержаних скринінговим методом у всьому діапазоні концентрацій (0,15 до 4,05 мкг/кг) калібрувальної кривої скринінгової методики ІФА/ELISA. Найбільша подібність  результатів спостерігається для зразків молока в концентраціях близьких до значення четвертої калібрувальної точки (0,450 мкг/кг), відповідно 7,59 і 4,35%. Враховуючи одержані нами дані можна зробити висновок про найбільшу достовірність результатів одержаних методом ІФА/ELISA в цьому діапазоні концентрацій.

Одержані результати свідчать про доцільність застосування скринінгових методів на різних ланках контролю за вмістом залишків хлорамфеніколу.  Зокрема, на етапах первинного контролю відповідно до принципів НАССР (Hazard Analysis Critical Control Point система що передбачає контроль безпеки продукту на всіх етапах від вирощування і переробки до реалізації), можливо здійснювати контроль за вмістом хлорамфеніколу методом ІФА/ELISA. Для широкого кількісного контролю в системі державних лабораторій ветеринарної медицини також доцільно застосування методу ІФА/ELISA, який надійно  встановлює відсутність в продуктах та сировині залишків хлорамфеніколу, і не потребує підтвердження негативного результату. Лише у випадках одержання позитивного результату доцільно застосовувати метод РХ/МС/МС, який дає підставу однозначно встановити кількісний вміст залишків ХАФ за такими критеріями, як однаковий час виходу хроматографічних піків аналіту і стандарту, наявність батьківського мас-іону та не менше ніж трьох продукт мас-іонів, що відповідають стандарту та їх кількісним співвідношенням на тому ж рівні що і у  стандартних зразках.


Теми:  Мікотоксини