Вхід на сайт

Реєстрація  |   Я забув пароль

Етіологічна діагностика нейроінфекцій

28 серпня 2013

Етіологічна верифікація нейроінфекцій є головним принципом клінічної медицини, необхідною умовою для вибору правильної спе­цифічної терапії. Діагноз менінгіту чи енцефаліту має синдромальний характер і без порозуміння їх причинності утруднюється вибір терапії та прогноз перебігу захворювання. Сучасна етіологічна розшифровка нейроінфекцій базується на різноманітних лабораторних дослідженнях, які основані на визначенні збудника, його антигенів або виявленні реакції самого організму у формі специфічного антитілоутворення.

Збудники нейроінфекцій виявляються при мікроскопічному, бактеріо­логічному або вірусологічному дослідженнях крові, спинномозкова рідина (СМР), випорожнень, слини. Серологічні реакції засновані на виявленні ан­тигенів збудника або виявленні специфічних антитіл та зростання їх титру в динаміці захворювання при використанні методу парних си­роваток (ІФА, РПГА та ін.).

Мікроскопія

  1. Пряма мікроскопія: досліджують СМР або кров, набрану з пальця або з вени методом "товстої краплі". Проводиться при підозрі на менін­гококову інфекцію, малярію. Виявляють збудника.

  2. Дослідження мазків, пофарбованих за Грамом: для дослідження мазків СМР збирають у три пробірки (по 4 краплі у кожну) для мазка за Грамом, а також для пофарбування на кислотостійкі бактерії. Візу­альна оцінка мазків проводиться таким чином: до 10х3 одиниці на мл (КФО/мл) свідчить про наявність 25 % грампозитивних збудників, 10х3-10х5 КФО/мл - 60 % грампозитивних і більше 10х5 КФО/мл – 97 % грампозитивних бактерій.

Бактеріологічне обстеження

Матеріалом може бути:

  • стерильна кров, яку беруть з вени, засівають на спеціальне поживне середовище у співвідношенні 1:10. Попередню відповідь отри­мують через 24 години, остаточний бактеріологічний результат – че­рез 5-6 діб;

  • СМР – використовують другу стерильну порцію ліквору, зібрану у стерильних умовах у кількості 1-2 мл. Відповідь через 24-48 годин;

  • слиз: мазок слизу з носоглотки беруть натще або не раніше ніж через 3-4 години після прийому їжі з послідовним засівом на пожив­не середовище, у пробірку з транспортним середовищем або збагачу­вальним середовищем.

Вірусологічні дослідження

  1. Проводять методом імунофлюоресцентної мікроскопії, тобто реакції прямої (ПІФ) або   непрямої імунофлюресценції (РНІФ). Досліджують ліквор, змив слизу з носоглотки або фекалії. Цей метод належить до експрес-тестів.

  2. Культуральний метод – визначення цитопатогенності на куль­турі тканин тварин.

Цей метод є ретроспективним, трудомістким, дорогим і тому не отримав розповсюдженого застосування в клінічній практиці.

Молекулярна клінічна діагностика

Молекулярна клінічна діагностика – наука, яка виявляє причинність інфекційних та соматичних захворювань на молекулярному рівні, на основі визначення генів, нуклеїнових кислот та білків. Молекулярна клінічна діагностика побудована на двох методах дослідження:

  1. імунохімічний аналіз – виявляє взаємодію "моноклонального антитіла (Аb) із специфічним антигеном (Аg)". Можна тестувати будь-яку біологічну рідину організму (кров, ліквор, слину, мокротиння, випорожнення та ін.);

  2. ідентифікація нуклеїнових кислот – виявляє ДНК або РНК будь-якого біологічного організму (найпростіші, грибки, бактерії, хламідії, віруси) у будь-якому біологічному середовищі організму.

Методи імунохімічного аналізу

  1. Метод твердофазного імуноферментного аналізу (тІФА) – дослід­жен­ня проводиться в полістиролових планшетках із сорбованими на них Аg або Аb (в залежності від того, що необхідно виявити: Аg або Аb). Метод тІФА застосовують для якісної та інколи кількісної оцінки Аb и Аg у будь-якому біологічному середовищі. Специфічність та чутливість методу тІФА складає 98-99%.

  2. Імуноблотинг – якісний метод, який дозволяє з великою віро­гідністю визначати Аg або Аb в будь-якому біологічному середовищі організму. Специфічність і чутливість методу - 99-100 %. Метод імуноблотингу схожий на ІФА, проте фінальний етап дослідження поля­гає у переносі й іммобілізації біополімера (Аg або Аb) на пористу мембрану, де біополімер аналізують за допомогою імуносорбентів. Імуноблотинг завдяки своїй специфічності належить до референс-тестів (підтверджуючих).

  3. Радіоімунний аналіз (РІА) – високочутливий метод, який має велику кіль­кість модифікацій. Метод заснований на конкурентній взає­модії поміченого радіо­актив­ним ізотопом комплексу Аg-Аb. Спе­цифічність і чутливість методу складає 99-100 %. Метод РІА застосо­вується рідко внаслідок своєї екологічної небезпечності.

  4. Методи імунофлюоресцюючого аналізу засновані на взаємодії Аb с гомологічним Аg, при цьому спостерігається розпад флюорохрому з подальшим свіченням, яке реєструється в ультрафіолетовому мікрос­копі. Флюорохромами можна мітити Аb, Аg і компоненти комплемен­ту, що дозволяє також виявляти комплекси Аg-Аb. Існує дві моди­фікації тесту – прямий метод імуно­флюоресценції (ПІФ) і реакція непрямої імунофлюоресценції (РНІФ).

    Метод ПІФ заснований на прямому зв'язуванні поміченого флюорохромом Аb з гомологічним Аg. Модифікація РНІФ заснована на тому, що спочатку одержують Аb до А% (Аb першого порядку – Аb1), паралельно утворюються Аb другого порядку (АЬ2 проти Аb1). Одержані Аb2 мітять флюорохромом. Метод РНІФ дозволяє вияви­ти локалізацію і кількість Аb1, пов'язаних з гомологічними Аg завдяки взаємодії Аb1 з Аb2. Згадані     методи достатньо прості і чутливі (70 - 90 %)> ПРИ цьому РНІФ вважається більш чутливим і специ­фічним тестом. Проте для обох модифікацій характерні загальні не­доліки: наявність власної флюоресценції мікроорганізмів, перехрес­них імунологічних реакцій, неспецифічне фарбування матеріалу по­міченими імунореагентами.

  5. Імуноафінна хроматографія – метод, заснований на взаємодії між Аg і Аb, де один з них, відповідно (Аg або Аb), може бути сорбований на нерозчинній матриці, виконуючи роль імуносорбенту. Це один з перспективних методів лабораторної діагностики, тому що він поєднює швидкість проведення аналізу (за 10 хвилин) з достат­ньою специфічністю і чутливістю методу (98-99 %). Метод не потре­бує дорогого обладнання.

  6. Латекс-аглютинація – заснована на аглютинації Аb або Аg, сорбовано­му на латексі, з комплементарним Аg або Аb. Це – метод експрес-діагностики, але чутливість та специфічність методу посту­пається тІФА, імуноблотингу, РІА.

Методи ідентифікації нуклеїнових кислот

Існують два способи молекулярно-генетичного аналізу – метод гібри­дизації і метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Метод вияв­ляє ДНК або РНК у будь-якій біологічній рідині. В основі цих двох засобів лежить властивість нуклеї­но­вих кислот до саморепродукції in vitro. Найбільш широко використовується ПЛР (специфічність 99-100 %, чутливість 98~99 %). При багатьох інфекційних ураженнях ПЛР стала стандартним діагностичним тестом, який використовують замість біопсії мозкової тканини та звичайних методик виділення вірусів, рідко - бактерій. Результати ПЛР, отримані протягом ос­танніх років, значно розширили можливості етіологічної діагностики інфекційних уражень ЦНС; в окремих випадках (при герпетичному енцефаліті), свідчать про "атиповість" проявів частини з них.

Фізико-хімічні методи аналізу

До фізико-хімічних методів належать оптичні засоби аналізу кількісної оцінки ступеня резорбції або переломлення світла, який проходить через досліджувану рідину. Розрізняють: фотометрію, реф­рактометрію, поляриметрію. В клінічній практиці найбільш широко використовується фотометрія, яка містить: спектрофотометрію, флюо­рометрію, вогняну фотометрію і нефелометрію. Але для верифікації етіології інфекції використовується тільки нефелометрія. Інші засоби фотометрії (спектрофотометрія, флюорометрія, полум'яна фотомет­рія) застосовуються для оцінки біохімічних показників організму.

Нефелометрія – визначення концентрації зависі агломератів (наприклад, комплексів Аg-Аb) або високомолекулярних рідин (Аg або Ab) у розчині аналізу інтенсивності розсіювання світла, який проходить через цей розчин.

Джерело: Ураження центральної нервової системи при інфекційних захворюваннях у дітей. Навчальний посібник за ред. проф. Л.Р. Шостакович-Корецької, проф. Л.А. Дзяк
Рекомендовано Центральним методичним кабінетом з вищої медичної освіти МОЗ України як навчальний посібник для студентів вищих медичних навчальних закладів III-IV рівнів акредитації
(протокол №3 від 04.07.2003).
Дніпропетровськ, Арт-Прес, 2004

Диагностический центр (dialab.dp.ua)


Теми:  Клінічна діагностика