Вхід на сайт

Реєстрація  |   Я забув пароль

Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L- лактат: цитохром с-оксидоредуктази Hansenula polymorpha

28 серпня 2013

Смуток Олег Володимирович. Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L- лактат: цитохром с-оксидоредуктази Hansenula polymorpha : дис... канд. біол. наук: 03.00.07 / НАН України; Інститут біології клітини. — Л., 2007. — 140арк. : табл., рис. — Бібліогр.: арк. 120-140.


Актуальність теми. Молочна кислота – універсальний метаболіт живих організмів, кінцевий продукт утилізації цукрів у молочнокислих бактерій та важливий компонент багатьох харчових продуктів, вихідна сировина для синтезу біодеградабельного полімеру - полілактату.

Визначення вмісту лактату має важливе значення у клінічній діагностиці, бродильному виробництві та контролі якості харчових продуктів. Рівень молочної кислоти у крові служить важливим клініко-діагностичним індикатором гіпоксії, молочнокислого ацидозу, шокового стану, гострого інфаркту міокарду і має значне прогностичне значення в реанімаційній терапії. Моніторинг рівня цього метаболіту в крові спортсменів є важливим засобом контролю за тренувальним процесом і використовується для оцінки ефективності відповідних тренажерів та тренувальних режимів.

Засвоєння молочної кислоти пекарськими дріжджами Saccharomyces cerevisiae здійснюється через селективне окислення L- і D- лактату, яке каталізується мітохондріальною L-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.3; флавоцитохром b2, ФЦ b2) і D-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.4). Ці білки кодуються генами CYB2 і DLD1, відповідно. Фермент, отриманий із S. cerevisiae та Hansenula anomala, - гомотетрамер, кожна субодиниця якого містить по одній молекулі флавінмононуклеотиду і протогему ІХ. Флавоцитохром b2 завдяки своїм унікальним каталітичним властивостям (абсолютна специфічність до L-лактату, відсутність у потребі екзогенного кофактора) може мати важливе біоаналітичне значення, оскільки може замінити NAD+-залежну лактатдегідрогеназу (ЛДГ) м’язів ссавців або бактерійну лактатоксидазу (ЛО) при визначенні вмісту L-лактату в біологічних рідинах та харчових продуктах за допомогою ензиматичних та біосенсорних підходів. Широке використання ФЦ b2 із S. cerevisiae у біоаналітиці гальмується високою лабільністю фермента та складністю процедури його виділення. З огляду на це, скринінг дріжджів - потенційних продуцентів стабільних форм ФЦ b2 є дуже актуальним.

Дана дисертаційна робота є результатом досліджень, проведених автором на базі Інституту біології клітини НАН України, в якому одним із напрямків досліджень є розробка нових ензиматичних та біосенсорних підходів для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась у рамках бюджетних тем: “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (№ держреєстрації 0102U000614), “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах” (№ держреєстрації 0103U004741) комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”.

Робота виконувалась також у рамках міжнародного наукового гранту INTAS FOOD CALL 00-0715 “Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme еlectrodes and kits” та міжнародних індивідуальних проектів: INTAS for Young Scientists OPEN CALL 2005 Nr. 05-109-5207 “Construction of flavocytochrome b2-overproducing strain by the use of CYB2 gene-containing expression cassette, bioanalytical application of the recombinant enzyme as a bioselective element of an analytical kit and amperometric sensor”; FEMS-2006 (І) “Application of cells of methylotrophic yeast Halsenua polymorpha and enzyme from this source for development of new L-lactate selective bioanalytical approaches” та West-Ukrainian BioMedical Research Center (WUBMRC-2006) “Development of a novel L-lactate selective enzymatic kit based on flavocytochrome b2 from methylotrophic yeast Hanlsenua polymorpha and its biomedical testing”.

Мета та завдання роботи. Метою роботи був пошук мікробних продуцентів стабільної форми ФЦ b2 та створення на основі цього ферменту нових ензиматичних і біосенсорних методів аналізу L-лактату.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання:

  • провести скринінг різних видів та штамів дріжджів за підвищеним синтезом та стабільністю ФЦ b2;

  • дослідити механізми регуляції синтезу ФЦ b2 у найперспективнішого продуцента стабільного ферменту;

  • оптимізувати умови культивування дріжджів з метою підвищення рівня синтезу ФЦ b2;

  • розробити оптимальну схему виділення та очистки ФЦ b2 з клітин відібраного продуцента;

  • отримати в препаративних кількостях високоочищений препарат ФЦ b2 H. polymorpha та провести його фізико-хімічну характеристику;

  • розробити L-лактат-селективні амперометричні біосенсори з використанням вільнодифундуючих медіаторів та синтетичних осмій-вмісних редокс-полімерів;

  • розробити новий ензиматичний підхід аналізу L-лактату з використанням ФЦ b2 H. polymorpha;

  • порівняти аналітичні параметри розроблених методів аналізу та апробувати їх на модельних та реальних зразках.

Об’єктом дослідження був пошук продуцента термостабільної форми ФЦ b2 H. polymorpha, виділення і очистка ферменту та дослідження його фізико-хімічних характеристик.

Предметом дослідження було вивчення регуляції синтезу ФЦ b2 H. polymorpha та створення на його основі нових ензиматичних та біосенсорних аналітичних підходів визначення вмісту L-лактату.

Методи дослідження: спектрофотометричний аналіз активності фермента, нативний та денатуруючий електрофорез білків, йонообмінна хроматографія, фізико-хімічні методи аналізу ферментів, циклічна вольтамметрія, амперометрія, ензиматичний та біосенсорний аналіз, статистичний і кореляційний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2 та відібрано штам H. polymorpha 356 як найперспективніший. Досліджено особливості регуляції синтезу та деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha.. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів.

Розроблено лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів на основі високоочищеного препарату ФЦ b2 H. polymorpha з використанням вільнопроникаючих медіаторів та осмій-вмісного полімерного медіатора. Досліджено аналітичні характеристики біосенсорів. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату з використанням флавоцитохрому b2 H. polymorpha.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофорезу значно полегшує процедуру скринінгу мікробних продуцентів ферменту та контроль його хроматографічної очистки і може бути використаний в інших наукових дослідженнях, пов’язаних із ФЦ b2. Ензиматично-фотометричний метод аналізу та амперометричні біосенсори використано для кількісного визначення L-лактату в реальних зразках вин. Висока селективність і простота визначення запропонованими підходами значно полегшують процедуру аналізу L-лактату і можуть замінити використовувані у практиці низькоселективні хімічні та дорогі ензиматичні методи на основі NAD+-залежної ЛДГ та ЛО.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано здобувачем самостійно. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2. Досліджено особливості регуляції синтезу ФЦ b2 Hansenula polymorpha. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів (у співпраці із канд. хім. наук Гайдою Г.З.). Вивчено деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату на основі ФЦ b2 та супряженого відновлення нітротетразолієвого синього (НТЗС) до формазану.

Розробка лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів для аналізу L-лактату на основі ФЦ b2 H. polymorpha та вивчення їх аналітичних характеристик проводилась в лабораторії електроаналітичної хімії та сенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина) під керівництвом професора Вольфганга Шумана (W. Shuhmann).

У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Планування, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д. б. н., проф. Гончаром М.В.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були особисто представлені дисертантом на XXI Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), IV Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, Польща, 2002), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, Польща, 2003), конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2003), V Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling” (Київ, Україна, 2005), І Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2005), ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2006), XVII науковій сесії наукового товариства ім. Шевченка (Львів, Україна, 2006), Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна, 2006), наукових конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України (Львів, Україна, 2002 – 2006 рр.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 31 наукову працю, включаючи 5 статей у фахових виданнях (4 - у закордонних та 1 – у вітчизняному виданні), 26 тез доповідей на міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і обговорення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 140 сторінках машинописного тексту і

проілюстровано 54 рисунками та 2 таблицями. Список літератури охоплює 167 найменувань.Смуток Олег Володимирович. Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L- лактат: цитохром с-оксидоредуктази Hansenula polymorpha : дис... канд. біол. наук: 03.00.07 / НАН України; Інститут біології клітини. — Л., 2007. — 140арк. : табл., рис. — Бібліогр.: арк. 120-140. Актуальність теми. Молочна кислота – універсальний метаболіт живих організмів, кінцевий продукт утилізації цукрів у молочнокислих бактерій та важливий компонент багатьох харчових продуктів, вихідна сировина для синтезу біодеградабельного полімеру - полілактату. Визначення вмісту лактату має важливе значення у клінічній діагностиці, бродильному виробництві та контролі якості харчових продуктів. Рівень молочної кислоти у крові служить важливим клініко-діагностичним індикатором гіпоксії, молочнокислого ацидозу, шокового стану, гострого інфаркту міокарду і має значне прогностичне значення в реанімаційній терапії. Моніторинг рівня цього метаболіту в крові спортсменів є важливим засобом контролю за тренувальним процесом і використовується для оцінки ефективності відповідних тренажерів та тренувальних режимів. Засвоєння молочної кислоти пекарськими дріжджами Saccharomyces cerevisiae здійснюється через селективне окислення L- і D- лактату, яке каталізується мітохондріальною L-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.3; флавоцитохром b2, ФЦ b2) і D-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.4). Ці білки кодуються генами CYB2 і DLD1, відповідно. Фермент, отриманий із S. cerevisiae та Hansenula anomala, - гомотетрамер, кожна субодиниця якого містить по одній молекулі флавінмононуклеотиду і протогему ІХ. Флавоцитохром b2 завдяки своїм унікальним каталітичним властивостям (абсолютна специфічність до L-лактату, відсутність у потребі екзогенного кофактора) може мати важливе біоаналітичне значення, оскільки може замінити NAD+-залежну лактатдегідрогеназу (ЛДГ) м’язів ссавців або бактерійну лактатоксидазу (ЛО) при визначенні вмісту L-лактату в біологічних рідинах та харчових продуктах за допомогою ензиматичних та біосенсорних підходів. Широке використання ФЦ b2 із S. cerevisiae у біоаналітиці гальмується високою лабільністю фермента та складністю процедури його виділення. З огляду на це, скринінг дріжджів - потенційних продуцентів стабільних форм ФЦ b2 є дуже актуальним. Дана дисертаційна робота є результатом досліджень, проведених автором на базі Інституту біології клітини НАН України, в якому одним із напрямків досліджень є розробка нових ензиматичних та біосенсорних підходів для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах. Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась у рамках бюджетних тем: “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (№ держреєстрації 0102U000614), “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах” (№ держреєстрації 0103U004741) комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”. Робота виконувалась також у рамках міжнародного наукового гранту INTAS FOOD CALL 00-0715 “Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme еlectrodes and kits” та міжнародних індивідуальних проектів: INTAS for Young Scientists OPEN CALL 2005 Nr. 05-109-5207 “Construction of flavocytochrome b2-overproducing strain by the use of CYB2 gene-containing expression cassette, bioanalytical application of the recombinant enzyme as a bioselective element of an analytical kit and amperometric sensor”; FEMS-2006 (І) “Application of cells of methylotrophic yeast Halsenua polymorpha and enzyme from this source for development of new L-lactate selective bioanalytical approaches” та West-Ukrainian BioMedical Research Center (WUBMRC-2006) “Development of a novel L-lactate selective enzymatic kit based on flavocytochrome b2 from methylotrophic yeast Hanlsenua polymorpha and its biomedical testing”. Мета та завдання роботи. Метою роботи був пошук мікробних продуцентів стабільної форми ФЦ b2 та створення на основі цього ферменту нових ензиматичних і біосенсорних методів аналізу L-лактату. Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання: провести скринінг різних видів та штамів дріжджів за підвищеним синтезом та стабільністю ФЦ b2; дослідити механізми регуляції синтезу ФЦ b2 у найперспективнішого продуцента стабільного ферменту; оптимізувати умови культивування дріжджів з метою підвищення рівня синтезу ФЦ b2; розробити оптимальну схему виділення та очистки ФЦ b2 з клітин відібраного продуцента; отримати в препаративних кількостях високоочищений препарат ФЦ b2 H. polymorpha та провести його фізико-хімічну характеристику; розробити L-лактат-селективні амперометричні біосенсори з використанням вільнодифундуючих медіаторів та синтетичних осмій-вмісних редокс-полімерів; розробити новий ензиматичний підхід аналізу L-лактату з використанням ФЦ b2 H. polymorpha; порівняти аналітичні параметри розроблених методів аналізу та апробувати їх на модельних та реальних зразках. Об’єктом дослідження був пошук продуцента термостабільної форми ФЦ b2 H. polymorpha, виділення і очистка ферменту та дослідження його фізико-хімічних характеристик. Предметом дослідження було вивчення регуляції синтезу ФЦ b2 H. polymorpha та створення на його основі нових ензиматичних та біосенсорних аналітичних підходів визначення вмісту L-лактату. Методи дослідження: спектрофотометричний аналіз активності фермента, нативний та денатуруючий електрофорез білків, йонообмінна хроматографія, фізико-хімічні методи аналізу ферментів, циклічна вольтамметрія, амперометрія, ензиматичний та біосенсорний аналіз, статистичний і кореляційний аналіз. Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2 та відібрано штам H. polymorpha 356 як найперспективніший. Досліджено особливості регуляції синтезу та деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha.. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів. Розроблено лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів на основі високоочищеного препарату ФЦ b2 H. polymorpha з використанням вільнопроникаючих медіаторів та осмій-вмісного полімерного медіатора. Досліджено аналітичні характеристики біосенсорів. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату з використанням флавоцитохрому b2 H. polymorpha. Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофорезу значно полегшує процедуру скринінгу мікробних продуцентів ферменту та контроль його хроматографічної очистки і може бути використаний в інших наукових дослідженнях, пов’язаних із ФЦ b2. Ензиматично-фотометричний метод аналізу та амперометричні біосенсори використано для кількісного визначення L-лактату в реальних зразках вин. Висока селективність і простота визначення запропонованими підходами значно полегшують процедуру аналізу L-лактату і можуть замінити використовувані у практиці низькоселективні хімічні та дорогі ензиматичні методи на основі NAD+-залежної ЛДГ та ЛО. Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано здобувачем самостійно. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2. Досліджено особливості регуляції синтезу ФЦ b2 Hansenula polymorpha. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів (у співпраці із канд. хім. наук Гайдою Г.З.). Вивчено деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату на основі ФЦ b2 та супряженого відновлення нітротетразолієвого синього (НТЗС) до формазану. Розробка лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів для аналізу L-лактату на основі ФЦ b2 H. polymorpha та вивчення їх аналітичних характеристик проводилась в лабораторії електроаналітичної хімії та сенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина) під керівництвом професора Вольфганга Шумана (W. Shuhmann). У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Планування, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д. б. н., проф. Гончаром М.В. Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були особисто представлені дисертантом на XXI Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), IV Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, Польща, 2002), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, Польща, 2003), конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2003), V Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling” (Київ, Україна, 2005), І Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2005), ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2006), XVII науковій сесії наукового товариства ім. Шевченка (Львів, Україна, 2006), Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна, 2006), наукових конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України (Львів, Україна, 2002 – 2006 рр.). Публікації. За темою дисертації опубліковано 31 наукову працю, включаючи 5 статей у фахових виданнях (4 - у закордонних та 1 – у вітчизняному виданні), 26 тез доповідей на міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях. Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і обговорення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 140 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 54 рисунками та 2 таблицями. Список літератури охоплює 167 найменувань. http://www.lib.ua-ru.net/diss/cont/256496.html


Теми:  Roche, Enzytec, кислоти, ензиматичний аналіз, NADH